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一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內(nèi)神經(jīng)、循環(huán)、呼吸、消化、泌尿生殖等系統(tǒng)中， 特別是神經(jīng)組織中較豐富。它作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信息物質(zhì)，發(fā)揮信號(hào)傳遞的作用，是一

種新型的生物信使分子，在機(jī)體的生理、病理過(guò)程中起著重要的作用。

測(cè)定原理：

NO 在體內(nèi)或水溶液中極易氧化生成 NO2— ，在酸性條件下，NO2— 與重氮鹽磺酸胺生成重氮 化合物，進(jìn)一步與萘基乙烯基二胺偶合，產(chǎn)物在 550nm 處有特征吸收峰，測(cè)定其吸光值， 可以計(jì)算 NO 含量。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽或勻漿器、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。 試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL× 1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。（用之前震蕩溶解后使用）

試劑二：液體 6mL× 1 瓶，4℃避光保存。(用之前 60℃加熱震蕩 15min)

樣品處理：

1.    組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，

加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心 15min ，取上清，置冰上待測(cè)。

2.    細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建 議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g ，4℃ , 離心 15min ，取上清置于冰上待測(cè)。

3.    體液和培養(yǎng)液等其它液態(tài)樣品：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟和操作表：

1 、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm。

2 、操作表

NO 含量計(jì)算：

a.   用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.016x -0.0103 ，R2= 0. 9986

1 、組織樣品：

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

NO 含量(μmoL/g  鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷Cpr

2 、細(xì)胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）× 10-3 = 0.125×  ( ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

3 、其他樣品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣

= 125×  ( ΔA +0.0103）

V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積，

1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

b.   用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y= 0.008x - 0.0103 ，R2= 0. 9986

1 、組織樣品：

（1）按樣本重量計(jì)算

NO 含量(μmoL/g  鮮重）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

NO 含量(μmoL/mg prot）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr） × 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷ Cpr

2 、細(xì)胞：

NO 含量( μmol/104  cell）=( ΔA +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）× 10-3 = 0.25×  ( ΔA +0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）

3 、 其他樣品：

NO 含量(μmoL/L）=( ΔA +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣=250×  ( ΔA +0.0103）

V 反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V 樣：反應(yīng)中樣品體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL

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